Embriyoloji laboratuvarlarında, yumurtanın sperm ile döllenmesini sağlamak amacıyla IVF ve ICSI olarak adlandırılan iki farklı yöntem kullanılır;

IVF (In vitro Fertilization):

Tüp bebek tedavilerinde döllenmeyi sağlamak amacıyla kullanılan ilk yöntem olup, ilk olarak 1978 senesinde fizyolog Robert Edwards tarafından İngiltere’de başarıyla uygulanmıştır. Bu yöntemde, androloji laboratuvarı tarafından hazırlanan spermler embriyoloji laboratuvarında kümülüsleri temizlenmemiş yumurtalar ile aynı kültür ortamında biraraya getirilerek spermin yumurtayı doğal olarak döllemesi beklenir.

IVF uygulamasında sadece dölleme kapasitesi olan spermlerin yumurtaya girişi mümkün olduğu için doğal bir seçilim söz konusudur. Fakat bu durum, spermlerin dölleme potansiyellerinin yeterli değerlendirilmediği durumlarda yüksek oranda fertilizasyon başarısızlığına da yol açabilmektedir. Bu nedenle IVF işlemi uygulaması için doğru laboratuvar seçimi önem kazanmaktadır. IVF uygulamasında döllenme başarısızlığı yumurtaya bağlı sebeplerle de meydana gelebilmektedir. Bu nedenle yaygın yaklaşım, IVF planlanan ve çok sayıda yumurta toplanan vakalarda yumurtaların bir kısmında ICSI yöntemi kullanılmasıdır.

IVF işleminde yaygın uygulama oosit başına 50.000-100.000 arası ileri hareketli spermin oositin bulunduğu kültür ortamına inseminasyonu şeklindedir. Daha az sayıda sperm kullanımı fertilizasyon başarısızlığına, daha çok sayıda sperm kullanımı ise polispermi olarak tanımlanan, birden fazla spermin yumurtayı döllemesine yol açabilir. Bu şekilde döllenen yumurtalar genetik olarak anormal embriyo gelişimine yol açacağı için, gelişen embriyolar transfer için kullanılamaz.

ICSI-Mikroenjeksiyon (Intra Cytoplasmic Sperm Injection):

IVF uygulaması ile döllenme sağlama imkanı bulunmayan, sperm parametreleri (sayı, hareketlilik) düşük olan, şiddetli sperm morfolojik defektleri bulunan ya da testiküler yoldan sperm elde edilen vakalarda kullanılmak üzere geliştirilen bir yöntemdir. İlk olarak 1990 senesinde Prof. Gianpiero D. Palermo tarafından Brüksel’de başarıyla uygulanmıştır.

ICSI işleminin uygulanabilmesi için laboratuvarda belirli donanımların bulunması ve uygulayacak personelin bu konuda eğitimli ve yeterli beceriye sahip olması şarttır. ICSI işleminde kullanılan mikropipet olarak adlandırılan ve biri yumurtayı tutmak (holding pipeti) ve diğeri despermi yumurta içerisine enjekte etmek (mikroenjeksiyon pipeti) için kullanılan pipetler, mikroskoba monte mikromanipulatör olarak adlandırılan özel bir cihaz yardımıyla kontrol edilirler.

ICSI işlemi çok hassas mikro cerrahi işlemidir ve yukarıda bahsedilen şartların yeterli seviyede sağlanmaması halinde işlem sonrasında yüksek oranda fertilizasyon başarısızlığı, yumurtaların dejenerasyonu (canlılığını kaybedecek şekilde hasar görmesi), embriyo gelişimi ve kalitesinde problem gözlenmesi olasıdır.

ICSI işleminde sadece olgun olduğu tespit edilen yumurtalar kullanılır. İşlem için bahsedilen donanım ve şartlarda, yumurta başına bir adet olacak şekilde ileri doğru hızlı hareketli ve morfolojik olarak en düzgün spermler seçilip mikroenjeksiyon pipetiyle alınır ve sperm hareketliliğini yavaşlatan bir solüsyon içerisine aktarılarak burada sperm kuyruğu pipet darbesi ile kırılır. Bu işlemin amacı sperm kuyruğunu çevreleyen tabakaya (fibröz kılıf) ve içerisindeki hücre zarına hasar vererek, sperm sitoplazması içerisindeki oosit aktivasyon faktörü olarak tanımlanan ve oositin moleküler düzeyde spermin girişini algılamasını ve döllenmeyi sağlayacak zincir reaksiyonları başlatmasını sağlayan protein yapılarının (phospholipase C) oosit sitoplazmasına çıkışını sağlamaktır. İşlemin bitiminde yumurtalar taze kültür sıvısı içerisine aktarılarak fertilizasyon kontrolüne kadar inkübasyona bırakılır.

Fertilizasyon kontrolü:

Fertilizasyon kontrolü IVF/ICSI işleminden 10-18 saat kadar sonra inverted mikroskop ile yapılır. Bu kontrolde biri sperm diğeri yumurtaya ait bitişik pozisyonda 2 çekirdeğin (pronükleus-PN) ve ek olarak ikinci bir kutup cisimciğinin gözlenmesi normal fertilizasyon, bu aşamadan ilk bölünmeye kadar ki gelişim aşaması zigot olarak adlandırılır. Bu sürenin geçirilmesi halinde çekirdekler birleşeceği ve görünür olmalarını sağlayan çekirdek zarı dağılacağı için döllenme olup olmadığı ya da anormal bir döllenme olmuşsa tespiti mümkün olmayacaktır.

Fertilizasyon kontrolünde çeşitli anomaliler gözlenmesi de mümkündür. Bu anomaliler;

• MonoPN: Sadece 1 tane pronükleus gözlenmesi durumudur. Bu durumda yine de hücre bölünmesi ve embriyo gelişimi gözlenebilir fakat gelişen embriyo yüksek olasılıkla tek gamete ait kromozom setine sahip (haploid) olacağı için anöploid(sayısal kromozom anomalili) olacaktır. MonoPN durumu ayrıca çekirdek oluşum ve silinme zamanlamalarındaki asenkroniteden de kaynaklanabilir ve bu durumda  normal kromozom setine (diploid) sahip olabilir. Fakat bu durumda da gelişen embriyolarda çoğunlukla gelişim problemleri gözlenmektedir.
• 3PN: Normalde haploid olması gereken gametlerden birinin diploid olması nedeniyle ya da mikroenjeksiyon sırasında 1’den fazla sperm enjekte edilmesi nedeniyle oluşabilir. Çoğunlukla embriyo gelişimi gözlense de, gelişen embriyo çok yüksek ihtimalle anöploid olacağı için transferi tercih edilmez.
• MultiPN: 3 ve daha fazla sayıda çekirdek gözlenmesi durumudur. Embriyo gelişimi olsa dahi kesinlikle transfer edilmez.
• Fragmented PN: Normal boyutta 2 çekirdeğin yanında 1 veya daha fazla küçük çekirdeğin gözlenmesi durumudur. Çekirdeklerin birleşmesi sürecinde düzelebilir ve normal embriyo gelişimi gözlenebilir.
• PN boyutları farklı: Çekirdeklerden birinin diğerinden farklı büyüklükte olması durumudur. Gelişen embriyolarda çoğunlukla gelişim problemleri gözlenmektedir.
• Ayrık PN: Çekirdeklerin arasında değişen miktarlarda mesafe olması, bitişik olmamaları durumudur. Çekirdeklerin sitoplazma içerisinde pozisyonunu düzenleyen mikrotübül yapılarındaki problemlerden kaynaklandığı düşünülmektedir. Aynı yapılar hücre bölünmesini de yönettiği için çoğunlukla embriyo gelişiminde problemler ve gelişim duraksaması gözlenir